In der Anfangszeit des elektrischen Betriebes, als nur Teilstrecken fertiggestellt waren, fuhren die Züge ohne Liniensignal, erst ab 7. September 1925 erfolgte die Signalisierung der Züge mit Buchstaben, die als Symbole für die gefahrene Strecke dienten:
- G = Gürtellinie
- W = Wientallinie
- D = Donaukanallinie
Mit diesen drei Buchstabensymbolen und den sich daraus ergebenden Kombinationen konnten nun im Laufe der Jahre die verschiedensten Linienführungen bezeichnet werden: W, WG, GD, DG, G, WD und GW.
Ab der Aufnahme des Personenverkehrs auf der ersten Teilstrecke am 4. Juni 1925 hatte die Stadtbahn einen eigenen Tarif. Da eine Fahrt auf der Stadtbahn 30 Groschen, auf der Straßenbahn aber nur 20 Groschen kostete, benützten vorerst nicht viele Fahrgäste das teurere Verkehrsmittel.
Erst als ab 20. Oktober 1925 ein gemeinsamer 24-Groschen-Tarif eingeführt wurde, hatte die Stadtbahn, namentlich an Ausflugssonntagen, stets hohe Fahrgastfrequenz zu verzeichnen. Die dichte Zugsfolge in Abständen von durchschnittlich vier Minuten, der schnelle und sichere Betrieb und die Pünktlichkeit der Stadtbahn machten sie für die Wiener bald zu einem gern benützten Verkehrsmittel. Der Fahrscheinverkauf und die Fahrscheinkontrolle erfolgten in den Stationen. Die Lochzangen der Sperrenschaffner hatten verschiedenformige Markierdorne, die aus der Form der Fahrscheinlochung die Einsteigstelle erkennen ließen.
In den Stadtbahnstationen verkaufte man neben vorgedruckten Fahrscheinen auch "Selbstdruckerkarten", die vom Kartenverkäufer mittels einer kleinen Stempelmaschine an Ort und Stelle hergestellt wurden. Vorgedruckte Fahrscheine sind mit Stempelapparaten, den "Composteuren", entwertet worden.
Der Verkehr wurde von Beginn an mit einem Fahrer und einem Zugbegleiter pro Zug abgewickelt. Dem Zugbegleiter oblag außer der Zugabfertigung in den Stationen auch noch die Signalbeobachtung und die dienstliche Überwachung des Fahrers. In den Stationen wurde der Zugbegleiter beim Abfertigen durch stationäre Bahnsteigabfertiger unterstützt, die auch Lautsprecheransagen durchführten.
Der für die Stadtbahnwagen immer schon vorgesehene Einsatz auf Straßenbahnstrecken erfolgte ab 20. Oktober 1923. Die Stadtbahn-/ Straßenbahn-Übergangslinie "18 G" führte von Heiligenstadt auf der Stadtbahnstrecke bis vor die Station Gumpendorfer Straße, verließ dort den Stadtbahnbereich, um auf die Strecke der Straßenbahn überzuwechseln. Sie fuhr weiter auf den Gleisen der Straßenbahnlinie 118 bis zum Ost- und Südbahnhof. Diese Züge fuhren immer in einer Straßenbahn-Zugzusammenstellung (Triebwagen/Beiwagen/Beiwagen). In der Anfangszeit fuhren die 18G-Züge mit n-Beiwagen, nach dem Erscheinen der leichteren n1-Beiwagen im Jahr 1927 wurden dann ausschließlich diese auf Straßenbahnstrecken verwendet.
Die Schaffner für die Straßenbahnstrecke stiegen in der Station Burggasse zu. Schon ab 1927 fuhren die 18G-Züge während der Betriebszeit der Linie "G" nicht mehr bis Heiligenstadt, sondern nur noch bis zur Station Alser Straße. Ab dort fuhren sie über das Verbindungsgleis im Bahnhof Michelbeuern wieder auf die Straßenbahn, am Gürtel entlang bis zur Severingasse, unterfuhren dort den Stadtbahnviadukt und gelangten nach kurzer Fahrt auf dem Inneren Gürtel wieder auf die Stadtbahnstrecke in Fahrtrichtung Gumpendorfer Straße. Die Linie ist knapp vor dem Ende des Zweiten Weltkrieges, am 18. Februar 1945, eingestellt worden.
Die Stadtbahnwagen setzte man aber auch in anderen Bereichen des Straßenbahnnetzes ein, so zum Beispiel n1-Beiwagen auf Linien der Bahnhöfe, Floridsdorf und Kagran (Linien 16, 17, 117, 132 und 231) sowie kurzzeitig N-Triebwagen auf der Linie 57 des Bahnhofes Wienzeile. Aber auch ganze Züge wurden zum Beispiel auf der Linie 118 verwendet. Der jedoch bekannteste und auch am längsten durchgeführte Einsatz von Stadtbahnwagenzügen im Straßenbahnverkehr erfolgte auf der Linie 60, die vorn Bahnhof Speising betrieben wird, nämlich bis zum 14. Juni 1968!
Durch die Änderung der Gesetzeslage im Jahre 1934 wurde die Stadtbahn konzessionsmäßig zur Kleinbahn erklärt, wodurch seit damals die Vereinbarung über eine eventuelle Rückgabe der Stadtbahn an die Bundesbahn hinfällig war.